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Le genre Yersina comporte trois espèces pathogènes. Il s’agit de Y. enterocolitica, Y. pseudotuberculosis et Y. pestis. La virulence de ces bactéries dépend à la fois du chromosome et d’un plasmide d’environ 70 kb, appelé pYV pour « plasmid involved in Yersina virulence ». Il paraît très conservé dans ces trois espèces. Le plasmide pYV des Yersinia code des protéines, appelées Yop qui sont sécrétées dans le milieu environnent, par un système également codé par le plasmide. Le mode de sécrétion de ces protéines constitue l’archétype du système de sécrétion de type III. Le plasmide pYV code également une protéine de membrane externe appelée YadA et une lipoprotéine, Y1pA. Le plasmide pYV des souches européennes de Y. enterocolitica présente également un opéron ars qui confèrent à la bactérie la résistance à l’arsenic et aux dérivés arsenicaux.
Ce travail a été consacré à l’étude de la région s’étendant entre les coordonnées 63 et 68 kb de ce plasmide de virulence. La détermination de la séquence de cette région, comprise dans le fragment EcoRI-5 (60.4 kb – 69.6 kb) a révélé la présence de vestiges de gènes d’un opéron tra de plasmide conjugatif. Les fragments de gènes que nous avons identifiés sur le plasmide pYV de Yersinia enterocolitica ressemblent par leur séquence aux gènes traX et traI des opérons tra des plasmides F et R100. L’analyse de la séquence nous a également permis d’identifier un fragment homologue au gène nuc porte par le plasmide pKM101 et encodant une endonucléase. La fonction de cette endonucléase du plasmide pKM101 n’est pas encore connue, mais elle semble jouer un rôle dans la conjugaison bactérienne.
Il est peu vraisemblable que les gènes ont en effet été localisés à proximité de ceux-ci. La transposition de ces éléments d’insertion semble avoir affecté leur intégrité, et donc leur fonctionnalité. Toutefois, des expériences complémentaires sont nécessaires pour confirmer ce point

Yersinia enterocolitica --- Plasmids --- Operon --- Medical Laboratory Science

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Les cellules de la lignée tumorale MZ2-MEL portent plusieurs antigènes reconnus par des lymphocytes T cytotiques autologues. Deux de ces antigènes sont codés par des gènes appelés GAGE. Six messagers GAGE distincts avaient été isolés d’une banque d’ADNc de la lignée MZ2-MEL. Nous possédions également la séquence d’un gène GAGE cloné dans le phage LamdaGEM-11.
la première partie de ce travail a été consacrée à déterminer l’origine des différents messager sen établissant s’ils étaient issus de la transcription d’un seul gène ou de plusieurs gènes appartement à une famille. En criblant une bibliothèque d’ADNc avec une sonde GAGE, nous avons isolé deux nouveaux messages de séquence inédite. Nous avons également isolé 5 cosmides indépendants en criblant une banque d’ADN génomique avec une sonde GAGE. Deux gènes GAGE distincts clonés dans deux de ces cosmides ont été caractérisés. Ils sont transcrits chacun pour donner l’un des deux nouveaux messagers isolés. L’hypothèse de l’existence d’une famille de gènes est confrontée par l’hybridation d’un Southern blot d’ADN génomique avec une sonde GAGE. La diversité des bandes indique qu’il existe une famille de gènes conservés.
La conservation des gènes GAGE au cours de l’évolution a été examinée en hybridant un Southern blot d’ADN génomique de différentes espèces avec une sonde GAGE. A l’exception du singe, aucun signal n’a été observé, ce qui indique que les gènes GAGE sont très peu conservés, même chez les mammifères.
La dernière partie de ce travail a été consacrée à l’étude de l’expression des gènes GAGE. Nous avons cloné un fragment de 1012 pb de la région 5’ d’un gène GAGE dans un plasmide contenant le gène rapporteur de la luciférase et nous l’avons transfecté dans différentes lignées tumorales exprimant ou n’exprimant pas les gènes GAGE. Les résultats indiquent que l’activité transcriptionnelle du promoteur AGE est environ deux fois plus élevée dans les lignées qui expriment les gènes GAGE que dans les lignées qui ne les expriment pas. Nous avons terminé ce travail par une analyse de la méthylation des régions promotrices des gènes GAGE en hybridant un Southern blot d’ADN de différentes lignées tumorales digéré par MspI ou HpaII. Nous avons observé une corrélation entre la déméthylation des sites HpaII situés dans la région promotrice et l’expression des gènes GAGE

Antigen, Neoplasm --- ADP Ribose Transferases --- Medical Laboratory Science

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La 2-chloro-2’-désoxyadénosine (CdA) est un nucléoside de synthèse, analogue de la 2’-désoxyadénosine. Elle est utilisée actuellement pour le traitement de plusieurs types de pathologies, en particulier la leucémie à tricholeucocytes, pour laquelle elle est le traitement de choix, et la leucémie lymphoïde chronique (LLC). Dans ce dernier cas, une résistance au traitement se manifeste d’emblée chez un pourcentage assez élevé de patients.
Le CdATP étant considéré comme le métabolite cytotoxique de la CdA, il a été proposé pour expliquer la résistance de certains patients à la CdA, que les lymphocytes de ces derniers accumulaient moins de CdATP que les lymphocytes de patients sensibles à la CdA. Cette moindre accumulation de CdATP pourrait être due à une moindre activité de la deoxycytidine kinase (dCK), l’enzyme qui phosphoryle la CdA en CdAMP, et/ou à une activité plus élevée de 5’-nucléotidase (5’-NT), l’enzyme qui déphosphoryle, quoique non absoule, a pu être établie entre la réponse au traitement à la CdA et le rapport des activités dCK/5’-NT dans leurs lymphocytes. Dans ces travaux cependant, l’activité dCK avait été déterminée à des concentrations non thérapeutiques de CdA et celle de la 5’-nucléotidase avec un autre substrat que le CdAMP, ce qui pourrait éventuellement mener à des interprétations incorrectes.
Nous avons dès lors décidé, et c’est l »objet de notre travail, d’étudier le rapport des activités dCK/5’-Nt non pas dans des extraits de lymphocytes mais dans des lymphocytes intacts, incubés en présence de doses thérapeutiques de CdA, dans le but d’avoir un test qui permettrait de prédire la sensibilité du patient atteint de LLC à la CdA. La première partie de notre travail a consisté à mettre au point la mesure de la phosphorylation de la CdA et de la déphosphorylation de ses nucléotides dans les lymphocytes isolés du sang périphérique de patients atteints de LLC, puis de comparer la vitesse de ces 2 processus chez différents patients. La méthode est maintenant au point mais le nombre de patients que nous avons pu analyser n’est pas suffisant pour qu’on puisse en tirer des conclusions d’un point de vue prédictif.
Comme la récolte de prélèvements sanguins n’a pas toujours été facile, nous avons testé dans un second volet de notre travail l’effet de la cryopréservation sur la phosphorylation de la CdA et la déphosphorylation de ses nucléotides. Nous avons pu montrer que les lymphocytes cryopréservés puis décongelés se comportaient comme des lymphocytes frais, ) condition qu’ils aient été prélevés et isolés comme ces derniers. Ces informations permettront de faciliter la suite de cette étude et un changement dans la façon de conserver les lymphocytes à L’ESP

Leukemia, Lymphocytic, Chronic, B-Cell --- Cladribine --- Medical Laboratory Science

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Le stress oxydatif, caractérisé par un profond déséquilibre oxydoréducteur de la cellule, conduit à la formation de composés capables de réagir avec les macromolécules cellulaires. Pour faire face à l’atteinte oxydative, les cellules disposent de systèmes de défense, chargés d’éliminer les espèces oxydantes, et de systèmes de réparation qui interviennent lorsque les lésions se sont déjà produites.
L’ADN est une cible des agents oxydants. Ceux-ci peuvent induire des cassures de brins ou/et des sites labiles en milieu alcalin. Nous avons mis en évidence par la technique de l’élétrophorèse en gel d’agarose que l’agent inducteur de stress oxydatif utilisé dans nos expériences, l’hydroperoxyde de tert-butyle, n’induit pas de fragmentation de l’ADN des hépatocytes isolés. Les cassures que nous avons observées par la technique de FADU (Fluorimetric Analysis of DNA Unwinding) sont donc de types simple brin.
La poly(ADP-ribose) polymérase, enzyme nucléaire, reconnait les cassures de brins et est activée par celles-ci. Elle catalyse alors le transfert d’unité (ADP-ribose) depuis le NAD+ sur elle-même et sur d’autres protéines nucléaires.
Lorsque les lésions à l’ADN sont trop importantes, le contenu intracellulaire en NAD+ diminue suite à sa consommation par la poly(ADP-ribose) polymérase activée. C’est effectivement ce que nous avons observé lorsque des hépatocytes isolés de rat sont incubés en présence d’un inducteur expérimental du stress oxydatif : l’hyperperoxyde de tert-butyle.
Néanmoins, cette diminution du taux en NAD+ n’est pas responsable de la perte en ATP ni de la lyse cellulaire observées dans ces mêmes conditions. La cytotoxicité du peroxyde n’est don c pas expliqué par la voie d’activation de la poly(ADP-ribose) polymérase suite à) des cassures de brins de l’ADN

Oxidative Stress --- ADP Ribose Transferases --- Medical Laboratory Science --- Tert-Butylhydroperoxide

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Depuis quelques années, le domaine de la nutrition connait un essor sans précédent. Des travaux récents s’interrogent sur l’impact des glucides sur la santé (pour revue, Hirsch, 1995). Un apport important en glucides digestibles dans le régime alimentaire génère des altérations au niveau des lipides plasmatiques, principalement une augmentation des triglycérides. Celle-ci semble être liée à l’induction de la lipogenèse (pour revue, Frayn et Kingsman, 1995). La lipogenèse est la voie métabolique qui permet la synthèse de novo d’acides gras majoritairement à partir de glucose ou de fructose. Les sites essentiels de la lipogenèse sont le foie, les tissus adipeux blanc et brun, et, à moindre degré, la glande mammaire lors de la lactation. L’intensité de la lipogenèse dans ces tissus varie en fonction des espèces. Chez le rat, son intensité est à peu près équivalente dans les tissus hépatique et adipeux. Chez l’homme, par contre, il semble qu’elle soit principalement hépatique (Foufelle et coll, 1992).
Chez le rat, l’induction de la synthèse des acides gras est observé lors de la transition allaitement-sevrage, mais aussi au moment de l’ingestion d’hudrates de carbone après un jeûne (Katsurada et coll, 1990 ; Iritani et coll., 1992 ; Girard et coll., 1994). Cet effet résulte principalement des modifications du taux transcriptionnel des gènes codant pour les enzymes lipogéniques. La plupart des auteurs s’attachent à expliquer le mécanisme de l’induction nutritionnelle des enzymes lipogéniques, mais peu d’entre-eux ont décrit les conséquences métaboliques d’un tel phénomène. Dans le foie, les acides gras nouvellement synthétisés sont de bons substrats pour l’estérification, et donc pour la formation de triglycérides (TG) et phospholipides (PL). Ces TG et PL sont exportés du foie via les VLDL (very low density lipoprotein) (Duerden et Gibbons, 1988). Un déséquilibre entre le taux de synthèse des TG ; et le taux de TG secrétés par les hépatocytes peut provoquer une accumulation de lipides dans le foie. Cette surcharge hépatocytaire est connues sous le nom de stéatose, et est l’une des altérations hépatiques les plus communes chez l’homme (Ivanoz et coll., 1992).
le but de ce travail est de tester l’hypothèse selon laquelle, chez le rat, un jeûne suivi d’un régime hyper-glucidique (HG) peut provoquer un déséquilibre métabolique qui conduit à des altérations morphologiques du foie, principalement à une accumulation de lipides dans les hépatocytes

Fatty Liver --- Enzyme Induction --- Disease Models, Animal --- Medical Laboratory Science